உயிர் வேதியியல் & பகுப்பாய்வு உயிர்வேதியியல்

சுருக்கம்

பயோடெக்னாலஜி காங்கிரஸ் 2015 : ஃபெட்-பேட்ச் செயல்முறைகளில் வேதியியல் மாற்றியமைக்கப்பட்ட சிஸ்டைன் மற்றும் CHO குறிப்பிட்ட உற்பத்தித்திறனில் தாக்கம் - அலின் ஜிம்மர் மெர்க் மில்லிபோர்

அலின் ஜிம்மர்

மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடிகள் போன்ற சிகிச்சை புரதங்களின் உற்பத்திக்கு பாலூட்டிகளின் செல்களின் தொழில்துறை ஊட்ட-தொகுதி சாகுபடி பயன்படுத்தப்படுகிறது. ஆரம்ப வளர்ச்சியை உறுதி செய்யும் நடுத்தரத்தைத் தவிர, வளர்ச்சி, உயிர்த்தன்மை மற்றும் ஆன்டிபாடி உற்பத்தியை மேம்படுத்த உணவு அவசியம். நிறுவப்பட்ட வணிக அமைப்புகளில் ஒரு சிறிய அமில செறிவூட்டப்பட்ட பிரதான தீவனம் மற்றும் எல்-டைரோசின் மற்றும் எல்-சிஸ்டைன் கொண்ட தனியான கார அமினோ அமில ஊட்டமும் அடங்கும். காற்று மற்றும் உலோக வினையூக்கிகளின் முன்னிலையில் சிஸ்டைனுக்கு டைமரைசேஷன் செய்வதால் எல்-சிஸ்டைன் நிலையாக இல்லாததால், அனைத்து அமினோ அமிலங்களையும் நடுநிலை pH ஊட்டங்களில் சேர்க்க நிலையான எல்-சிஸ்டைன் வழித்தோன்றல் தேவைப்படுகிறது. அந்த ஒற்றை ஊட்ட அமைப்புகள் உணவளிக்கும் திட்டங்களை எளிமைப்படுத்தவும், pH மற்றும் DO சிக்னல்களை நிலைப்படுத்துவதன் மூலம் ஒட்டுமொத்த செயல்முறை வலிமையை மேம்படுத்தவும் விரும்புகின்றன. சிறிய அளவிலான மற்றும் உயிரியக்கங்களில் பொருந்தக்கூடிய ஒரு தொழில்துறை ஒற்றை ஊட்ட-தொகுதி செயல்முறையில் பாஸ்பர் டைரோசின் டிசோடியம் உப்புடன் இணைந்து வேதியியல் ரீதியாக மாற்றியமைக்கப்பட்ட சிஸ்டைனைப் பயன்படுத்த பரிந்துரைக்கிறோம். மனித மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடியை வெளிப்படுத்தும் CHO சஸ்பென்ஷன் செல் லைன் கொண்ட சுழல் குழாய்கள் அல்லது உயிரியக்கங்களில் செல் கலாச்சார பரிசோதனைகள் மேற்கொள்ளப்பட்டன. சாத்தியமான செல் அடர்த்தி மற்றும் நம்பகத்தன்மை ஒரு தானியங்கி செல் எண்ணும் சாதனத்தைப் பயன்படுத்தி அளவிடப்பட்டது. நெடுவரிசைக்கு முந்தைய வழித்தோன்றல் மற்றும் UPLC பகுப்பாய்வு மற்றும் LC-MS/MS ஐப் பயன்படுத்தி வைட்டமின்களுக்குப் பிறகு அமினோ அமிலங்களுக்கு சூப்பர்நேட்டன்ட்களின் செலவழிக்கப்பட்ட ஊடக பகுப்பாய்வு மேற்கொள்ளப்பட்டது.

ஃபோட்டோமெட்ரிக் மற்றும் டர்பிடோமெட்ரிக் முறைகளை நம்பி செடெக்ஸ் பயோ எச்டி மூலம் வளர்சிதை மாற்ற அளவீடுகள் செய்யப்பட்டன. மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடியின் சிறப்பியல்பு கிளைக்கான் பகுப்பாய்வுகளுக்கு 2-AB லேபிளிங், சார்ஜ் மாறுபாடு பகுப்பாய்வுகளுக்கான cIEF மற்றும் பெப்டைட் மேப்பிங் சோதனைகளுக்கு LC-MS/MS ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது. மாற்றியமைக்கப்பட்ட சிஸ்டைன் வழித்தோன்றலைக் கொண்ட ஊட்டத்தின் நிலைப்புத்தன்மை ஆய்வுகள், மூலக்கூறு நிலையாக இருப்பதையும், அறை வெப்பநிலையில் அல்லது 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் சேமிக்கப்படும் போது மூன்று மாதங்களுக்குள் எல்-சிஸ்டைன் அல்லது எல்-சிஸ்டைன் வெளியிடப்படவில்லை என்பதைக் காட்டுகிறது. மேலும், காலப்போக்கில் ஊட்டத்தின் நிறத்தில் எந்த மாற்றமும் காணப்படவில்லை. எல்-சிஸ்டைன் அதே அளவு வேதியியல் மாற்றியமைக்கப்பட்ட சிஸ்டைன் மூலம் மாற்றப்பட்ட சிறிய அளவிலான தொகுதி சோதனைகள் வளர்ச்சி அல்லது நம்பகத்தன்மை சுயவிவரங்களில் எந்த மாற்றத்தையும் காட்டவில்லை. சிறிய அளவிலான ஃபெட்-பேட்ச் செயல்முறைகளில் மாற்றியமைக்கப்பட்ட சிஸ்டைன் வழித்தோன்றலின் பயன்பாடு, நிறுவப்பட்ட இரண்டு ஊட்ட அமைப்புடன் ஒப்பிடும்போது ஒப்பிடக்கூடிய அதிகபட்ச சாத்தியமான செல் அடர்த்தி, நீடித்த நம்பகத்தன்மை மற்றும் அதிகரித்த டைட்டரைக் குறிக்கிறது.

ஒற்றை ஊட்ட உத்தியை இரண்டு ஊட்ட மூலோபாயத்துடன் ஒப்பிடும் போது சிறிய அளவில் விவரிக்கப்பட்ட குறிப்பிட்ட உற்பத்தித்திறன் அதிகரிப்பதை உயிரியக்க சோதனைகள் உறுதிப்படுத்தின. மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடியின் ஆழமான குணாதிசயத்தில் கிளைகோசைலேஷன் அல்லது சார்ஜ் மாறுபாடு வடிவத்தில் எந்த மாற்றமும் இல்லை என்று குறிப்பிடப்பட்டுள்ளது, அதேசமயம் பெப்டைட் மேப்பிங் சோதனைகள் மோனோக்ளோனல் ஆன்டிபாடியின் வரிசையில் மாற்றியமைக்கப்பட்ட அமினோ அமிலத்தின் எந்த ஒருங்கிணைப்பையும் கண்டறிய முடியவில்லை. மோனோக்ளோனல் நியூட்ராலைசர் (எம்ஏபி) உருவாக்கத்திற்கான கிளம்ப் படிவங்களை பாலூட்டிகள் கவனித்துக்கொண்டன, இது ஒரு சில சப்ளிமெண்ட்ஸ், எடுத்துக்காட்டாக, குளுக்கோஸ், ஊட்டச்சத்துக்கள் மற்றும் அமினோ அமிலங்கள் ஆகியவை கலாச்சார நேரத்தை விரிவுபடுத்துவதற்கும் புரத உற்பத்தியை மேம்படுத்துவதற்கும் முக்கிய கவனிப்பைப் பொறுத்தது[1].உண்மையான நடைமுறைகளில், எல்- சிஸ்டைன் மற்றும் எல்-டைரோசின் ஆகியவை கரையக்கூடிய pH இல் சுயாதீனமாக பராமரிக்கப்படுகின்றன, ஏனெனில் அவற்றின் குறைந்த நிலைத்தன்மை மற்றும் பாரபட்சமற்ற நிலையில் குறைந்த கரைப்பு pH, pH டாப்ஸ் மற்றும் மழைப்பொழிவைக் கொண்டுவருகிறது[2]. கட்டிங் எட்ஜ் வடிவங்களை மேம்படுத்த, இரண்டு அமினோ அமிலங்களும் அவற்றின் குறிப்பிட்ட திடத்தன்மை மற்றும் கரைக்கும் தன்மையை மேம்படுத்த செயற்கையாக மாற்றப்பட்டுள்ளன. பாஸ்போடைரோசின் டிசோடியம் உப்பு (PTyr2Na) ஒரு நிலையான எல்-டைரோசின் துணை மற்றும் பக்கச்சார்பற்ற pH இல் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதை கடந்த கால ஆய்வுகள் வெளிப்படுத்தியுள்ளன, மேலும் இது வாழ்க்கைச் செயல்பாட்டின் வழி அல்லது mAb தரப் பண்புகளைக் கண்டறியாமல் பார்த்துக் கொள்கிறது[3]. ஒரு பாரபட்சமற்ற pH, ஒற்றை ஊட்ட கட்டமைப்பில் L-cysteine ​​துணை நிறுவனத்தைப் பயன்படுத்துவதன் விளைவுகளை இங்கே நாங்கள் வழங்குகிறோம்.

L-cysteine ​​துணை நிறுவனத்தின் நம்பகத்தன்மையானது, பாரபட்சமற்ற pH, CellventoTM Feed-220 இல் ஒரு வருடத்தின் காலாண்டில் அறை வெப்பநிலையில் அல்லது 4°C இல் மதிப்பிடப்பட்டது. குழு சமூகங்களை கவனித்துக்கொள்வதற்காக, மனித mAb ஐ தொடர்பு கொள்ளும் CHO K1 குளோன் பயன்படுத்தப்பட்டது. உருப்படி செயல்முறை திசையில் சுட்டிக்காட்டப்பட்டபடி, Cellvento™ CHO-220 மீடியா கட்டமைப்பில் வளர்ச்சி செயல்பட்டது. கட்டுப்பாடுகளுக்கு, Cellvento™ Feed-220 மற்றும் வேறுபட்ட அடிப்படை சிஸ்டைன்/டைரோசின் ஊட்டம் பயன்படுத்தப்பட்டது, இருப்பினும் ஒற்றை ஊட்டச் செயல்பாட்டில், L-cysteine ​​துணை நிறுவனம் மற்றும் PTyr2Na ஆகியவை பாரபட்சமற்ற pH, முதன்மை ஊட்டத்தில் சட்டப்பூர்வமாக கரைக்கப்பட்டன. டர்ன் டியூப்கள் மற்றும் 1.2லி உயிரியக்கங்களில் சோதனைகள் செயல்பட்டன. ViCell® ஐப் பயன்படுத்தி வளர்ச்சி மற்றும் நியாயத்தன்மை காணப்பட்டது, Cedex Bio HT ஐப் பயன்படுத்தி டைட்டர் தீர்க்கப்பட்டது மற்றும் டைட்டர், முக்கிய சாத்தியமான செல் தடிமன் மற்றும் பலவீனம் ஆகியவற்றைப் பொறுத்து வெளிப்படையான லாபம் தீர்மானிக்கப்பட்டது.

செலவழிக்கப்பட்ட ஊடக விசாரணைக்காக, எல்-சிஸ்டைன் துணை நிறுவனம் மற்றும் அமினோ அரிக்கும் அளவீடு UPLCusing AccQ·TagTMUltra Reagent மூலம் செய்யப்பட்டது. ஊட்டத்தின் பதிலளிக்கக்கூடிய திறனை மதிப்பிடுவதற்கு, H2DCFDA ஆனது பாரபட்சமற்ற pH இல் சேர்க்கப்பட்டது, Cellvento™ Feed-220 மேம்படுத்தப்பட்டது அல்லது துணையுடன் இல்லை. உள்செல்லுலார் பதிலளிக்கக்கூடிய இனங்கள் மதிப்பீட்டிற்கு, செல்கள் கார்பாக்சி-H2DCFDA உடன் குறிக்கப்பட்டன மற்றும் ஃப்ளோரசன்ஸ் மதிப்பிடப்பட்டது. துணை நிறுவனத்தைப் பயன்படுத்துவதற்கான கலங்களின் வரம்பை மதிப்பிட, செல் லைசேட்டுகள் ஸ்பைக் செய்யப்பட்டு, வடிவ பொருட்கள் UPLC ஆல் மதிப்பீடு செய்யப்பட்டன. mAb பரிசோதனைக்கு, 2-AB குறிப்பிற்குப் பிறகு HPLC ஐப் பயன்படுத்தி N- கிளைகோசைலேஷன் அளவிடப்பட்டது, அதே சமயம் கட்டண மாறுபாடுகள் cIEF ஐப் பயன்படுத்தி தீர்க்கப்பட்டன.

பாரபட்சமற்ற pH ஊட்டத்தில் எல்-சிஸ்டைன் துணை நிலைத்தன்மை பற்றிய ஆய்வு, அறை வெப்பநிலையில் அல்லது 4 டிகிரி செல்சியஸ் வெப்பநிலையில் ஒரு வருடத்தில் கால் பகுதிக்கு மேல் வைக்கப்படும் போது, ​​கீழ்நிலை நிர்ணயம் அல்லது எல்-சிஸ்டைன்/எல்-சிஸ்டைன் வெளியேற்றத்தில் சரிசெய்தல் இல்லை என்பதை நிரூபித்தது. சோதனை நிலைமைகளின் கீழ் துணை நிலையாக இருப்பதைக் காட்டும் மழைப்பொழிவு அல்லது நிழல் மாற்றம் எதுவும் பார்க்கப்படவில்லை. ஒற்றை-ஊட்ட நடைமுறையுடன் கூடிய குழாய்களின் வளர்ச்சியைக் கவனித்தது, கட்டுப்பாட்டு நிலையுடன் முரண்படும்போது கடைசி டைட்டர்களை மேம்படுத்தத் தூண்டுகிறது. டர்ன் ட்யூப் முடிவுகள் உயிரியலில் உறுதி செய்யப்பட்டன, இது அதிக கடைசி சாத்தியக்கூறுகள், விரிவாக்கப்பட்ட டைட்டர்கள் மற்றும் ஒற்றை ஊட்ட முறையுடன் அதிக வெளிப்படையான லாபத்தைத் தூண்டுகிறது.

H2DCFDA ஐ பக்கச்சார்பற்ற pH ஆக விரிவடைந்த பிறகு, குறைந்த வண்ண ஆக்சிஜனேற்றம் மதிப்பிடப்பட்டது, Cellvento™ Feed-220 ஆனது, ஊட்டத்துடன் மட்டும் மாறுபட்டு, குறைந்த ஏற்றுக்கொள்ளும் திறனைக் காட்டுகிறது. கார்பாக்சி-எச்2டிசிஎஃப்டிஏவின் விரிவாக்கத்தின் மூலம் கீழ் செல்லுலார் வண்ண ஆக்சிஜனேற்றம் கண்டறியப்பட்டது, இது குழாயின் ஒற்றை ஊட்டத்தை மாற்றியமைக்கப்பட்டது, இது கீழ்நிலையைப் பயன்படுத்தும் போது குறைந்த உள்செல்லுலார் ஏற்பு இனங்களின் வயதைக் காட்டும் கொத்து சமூகங்களைக் கவனித்துக்கொண்டது. செல் லைசேட்டுகளாக ஸ்பைக் செய்யப்பட்ட இடத்தில், சிஸ்டைன் துணை சிஸ்டைனுக்கு பயன்படுத்தப்பட்டது. வழங்கப்பட்ட mAb இல் N-கிளைகோசைலேஷன் அல்லது சார்ஜ் மாறுபாட்டில் எந்த வேறுபாடும் அங்கீகரிக்கப்படவில்லை, இது அறிமுகப்படுத்தப்பட்ட அடிப்படை தர குணாதிசயங்களில் துணை நிறுவனத்தின் தாக்கத்தை நிரூபிக்கவில்லை. L-cysteine ​​துணை நிறுவனம் மற்றும் PTyr2Na ஆகியவை ஒரு பாரபட்சமற்ற pH கவனிப்பில் இணைக்கப்படலாம் மற்றும் கிளஸ்டர் படிவங்களை கவனித்துக்கொள்வதில் L-cysteine ​​இன் கிணற்றாகப் பயன்படுத்தப்படலாம் என்பதை இந்த ஆய்வு காட்டுகிறது. mAb அடிப்படை தர பண்புகளை பாதிக்காமல்.